Calidad del ADN extraído de biopsias incluidas en parafina para la detección/tipificación de VPH por PCR

Abstract

En la actualidad se observa un incremento constante en los casos de infección por VPH en los países de bajos ingresos; por su parte, los métodos para el diagnóstico de infección han tenido un gran avance mediante técnicas de biología molecular. Sin embargo, en los procesos de fijación de los tejidos de biopsias y la extracción del ADN se presentan dificultades que afectan la integridad de esta molécula lo que a su vez trae como consecuencia problemas en los procesos de amplificación a través de la PCR. Esto se debe principalmente a los efectos de la formalina utilizada en las técnicas de fijación requeridas para la conservación de los tejidos en bloques de parafina, estos efectos causan la degradación del ADN por lo tanto genera cambios en la calidad y cantidad de la molécula que se obtiene durante su extracción. Objetivo: Comparar la calidad del ADN total extraído de biopsias de lesiones del área genital incluidas en parafina con distintas variaciones en la técnica de extracción, mediante espectrofotometría y PCR para la detección y tipificación de VPH. Materiales y Método: Se seleccionaron nueve (9) Bloques de tejidos incluidos en parafina fijados en formalina (FFPE) a las cuales se les aplicó cuatro variaciones del primer paso del protocolo de extracción de ADN total para comparar la concentración, calidad e integridad del ADN mediante espectrofotometría y amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR de la región β-globina. Resultados: Con La variación de desparafinación mediante Xilol se obtuvo un rendimiento de ADN del 93%, mientras la variación con agua caliente para extraer la 7

parafina produjo un rendimiento del 87%, por su parte, la variación utilizando Tween-20 y calentamiento en microondas produjo un rendimiento del 86%; y la variación Tween-20 y calentamiento en termociclador rindió un 78%. Por PCR y visualización mediante electroforesis en agarosa 1,5% se observó que se obtuvieron amplificados junto a un smear o patrón de “chorreado” lo que implica que el ADN se obtuvo degradado. Conclusión: El mejor protocolo de extracción de ADN de biopsias incluidas en parafinas es aquel que incluye Xilol como componente de disolución de la parafina, porque produce mayor rendimiento de ADN durante el proceso de extracción, mientras por PCR se encontró que dicha molécula puede tener baja calidad para los procesos de amplificación, que puede estar relacionado con el tiempo que lleva el tejido incluido een parafina.